組織培養実験

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　H1-1　永田　拳吾

組織培養とは
植物体の一部分から完全な植物体を育てる方法のことです。ニンジンを例に挙げて説明すると、ニンジンの形成層の部分ひとかけらから一本の完全なニンジンができるということです。組織培養で生育された植物体は全て元となった植物と同じ形質を持っているため優良種や、朝鮮人参など採取が困難なものの大量生産などに利用されています。今回は市販のニンジンを使用します（後の後悔の原因）。

実験の目的
培地のインドール酢酸とカイネチンの濃度比を変え、どの部位が分化するかを調べる。

実験に使用するもの
ニンジン、コルクボーラー、包丁、ピンセット、メス、コニカルビーカー、１000mlビーカー、メスシリンダー、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ＭＳ-Ｇ培地、pHメーター、電子天秤、ヒーター付マグネチックスターラー、双眼顕微鏡クリーンベンチ、恒温槽、蒸気滅菌器、乾熱滅菌器、アルミホイル、サランラップ、濾紙、ＩＡＡ（インドール酢酸）、カイネチン、寒天、ショ糖（スクロース）、メス、エタノール、シャーレ、輪ゴム、ゴム手袋

使用器具は蒸気滅菌器に入れて１２０℃３０分間かける。殺菌した器具は５０％エタノールて保存する。また植物ホルモンは0.1mol/lの水酸化カリウム水溶液に溶かして使用する事とする。

実験schedule
１日目：放課後に器具を蒸気滅菌器にかけておく。
２日目：朝早く部室にきて器具を取り出しエタノールに入れる。培地の溶液を作り分注し、蒸気滅菌器に入れる。放課後、培地にニンジンを植える。
培地の製造
�@純水500mlをメスシリンダーで測りとり1000mlビーカーに入れ、ＭＳ-Ｇ培地13.5gと寒天5gとショ糖15gを加え、マグネチックスターラーで加熱しながらかき混ぜる。
�A植物ホルモンを入れる。
�B塩酸及び水酸化ナトリウム水溶液を使ってpH5.6に調整する。
�Cコニカルビーカーに約50mlずつ入れ、アルミホイルで蓋をする。
�D蒸気滅菌器で120℃20分間かけて滅菌したのち、自然冷却する。
以上を踏まえて、実験を行う。

実験の手順
�@中性洗剤でよく洗った人参を包丁でだいたい３等分に切り70%エタノールに２，３分浸す。 （以下の作業はクリーンベンチ内で行う。）
�A切ったもののうち真ん中のものの成層の部分（ニンジンを切ったとき、断面にある円形の白い筋の円周上）を打ち抜き、メスで5mmほどの厚さに切る。切ったものは濾紙を敷いたシャーレに置く。
�Bピンセットでニンジンを培地に置く。
�Cアルミニウムで蓋をして、輪ゴムで口をしばる。
�D恒温槽内部に25℃で安置する。

これを培地のＩＡＡとカイネチンの濃度比を変えた次の培地について行う。

培地Ａ：ＩＡＡ1.5mg/l、カイネチン1mg/l　　　75mg 50mg
培地Ｂ：ＩＡＡ1.5mg/l、カイネチン0.1mg/l 75mg 5mg
培地C：ＩＡＡ1.5mg/l、カイネチン0.01mg/l　　75mg 0.5mg

〜実験の考察〜

１回目の考察
培地Ａについて行なった。最初の実験であったので操作はかなりテキトーであった。植物ホルモンは水に溶かしたので完全に溶けず、寒天は２００５年賞味期限のものを使った。ニンジンは１０個中２個のみしか殺菌せず、しかもその殺菌は１００％エタノールで行なった。培地は１００％エタノールで殺菌したもののみカビなかった。しかし、当然ながら細胞も破壊されていたのでカルスの成長は進まなかった。そう、この時は決してニンジンを疑ったりはしなかった。

２回目の考察
培地Ａについて行なった。今回は殺菌をしっかりした。そしてし過ぎた。次亜塩素酸ナトリウム（ハイター）で殺菌したのだ。約３０％の。後にインターネットで調べたところ通常１％ほどで使うようです。結果は言うまでもなく全滅。ちなみに培地個数は１３個でこの日は金曜日でした。

↑クリーンベンチ	↑生前の培地

↑カビた培地たち↑
（右側はタマホコリカビという珍しいカビ）

３回目の考察
培地Ａについて行なった。今回は寒天が実験用の１級粉末寒天を使った。殺菌は１５％エタノールにのみ使用。その後３％エタノールで保存した。培地は５個。結果は１つカルスになりかけたが途中で止まった。途中で止まる？カビも生えてないのに。この時あたりからニンジンの鮮度を疑い始める。

余ったニンジンは、くつくつ煮込んで、いただきます！

４回目の考察
培地Bについて行なった。今回から植物ホルモンは0.1mol/lの水酸化カリウムに溶かして使用した。また寒天やショ糖の量を変えた。それぞれ５秒から１０秒、殺菌した？してなかった！仕方ないので、手でエタノールをすり込んだ。培地は、エタノール殺菌なし×３、７０％×２、５０％×２、２５％×２、１５％×２、１０％×１の計１２個。結果は全滅。

←カビが侵食してもはや原型を留めていない

５回目の考察
培地Cについて行なった。それぞれ５秒から１０秒ピンセットでつまんでエタノールにつけた。培地はエタノール殺菌なし×４、、５０％×２、２５％×２、１５％×２の計１０個。このうちエタノール殺菌なしのうち２個がカルスになった。かなり分化が進んだが、またもや途中で成長が止まる。どうやら全てはニンジンのせいのようだ、いや、そうに違いない。そうでなくてはならないのだ！

↑再分化が進んだカルス↑

まとめ
そもそも今回実験で使用したニンジンは普通の市販のものであった。そのため細胞が痛んでいたのが今回の実験の失敗の最大の原因だ。こちらに落ち度は全くないと言っても過言ではない、はず。まあ、操作中に細菌などが混入したのも事実ではあるが。ひとまず組織培養の実験はこれでひとまず締めくくりとしますが、新鮮なニンジンを安定して入手できるようになった時にはまた実験を再開しようと考えています。